Génotypage HLA-DRB1 PCR SSO Luminex d'individus algériens avec ou sans parodontiteLuminex SSO PCR HLA-DRB1 Genoptyping of algerian individuals with or without periodontitis

Introduction

Les deux facteurs de risque vrais impliqués dans l'apparition de la pathologie sont le facteur microbiologique et le facteur génétique (Bouchard, ¹⁹⁹⁸). De nombreuses études ont évalué la prévalence des spécificités de l'antigène HLA de classe I et II (Katz et al., ¹⁹⁸⁷ ; Alley et al., ¹⁹⁹³ ; Shapira et al., ¹⁹⁹⁴ ; Firatli et al., ¹⁹⁹⁶ ; Bonfil et al., ¹⁹⁹⁷ ; Hodge et al., ¹⁹⁹⁹ ; Machulla et al., ²⁰⁰² ; Stein et al., ²⁰⁰³ ; Zhang et al., ²⁰⁰⁴). Les liens entre les groupes spécifiques génétiques HLA et les différentes formes de parodontites varient en fonction de la population d'étude. L'étude sur une population de Marseille (Bonfil et al., ¹⁹⁹⁷) conclut que les sous-types HLA-DRB1 * 04:01/04/05/08 peuvent être considérés comme facteurs de risque pour la parodontite à progression rapide. Un groupe de chercheurs (Zhang et al., ²⁰⁰⁴) a étudié l'association du polymorphisme de l'allèle HLA-DRB1 * 15:01 et de la susceptibilité à la parodontite chronique dans une population de Chine ; il suggère que cet allèle puisse être un indicateur de risque pour la susceptibilité à la parodontite chronique (PC) et que le génotype homozygote HLA-DRB1 * 15:01 soit associé de façon significative à la parodontite chronique. En revanche, une étude sur une population d'Allemagne (Machulla et al., ²⁰⁰² ; Stein et al., ²⁰⁰³) met en lumière la diversité des associations HLA de classes I et II et la difficulté d'assigner des marqueurs HLA simplement à la maladie parodontale. Dans des études ultérieures, nous avons démontré que la parodontite agressive a une part génétique dans notre population algérienne (Saidi-Ouahrani et al., 2006a, 2006b). Notre objectif dans cette étude est de faire un génotypage HLA-DRB1 de notre population présentant une parodontite agressive ou chronique et de sujets sans aucune parodontite pour essayer de voir une association entre un marqueur HLA-DRB1 et une parodontite.

Matériel et méthodes

Population de l'étude

Tous les patients sont examinés dans un service de parodontologie hospitalo-universitaire d'Algérie. Ils sont tous d'origine algérienne. Un questionnaire est établi sur l'état civil, l'interrogatoire et l'anamnèse (antécédents généraux et stomatologiques, antécédents familiaux, histoire de la maladie et motif de la consultation). L'examen clinique comprend un examen exobuccal (symétrie, articulations temporo-mandibulaires, muscles, adénopathies) et un examen endobuccal comprenant l'évaluation de l'hygiène par l'indice de plaque (IP), l'aspect de la gencive (volume, texture, forme, couleur), en utilisant, l'indice d'inflammation gingivale (GI), l'indice de saignement sulculaire (ISS) pour mesurer le saignement. Une sonde parodontale graduée permet de mesurer la profondeur des poches ; 6 sondages pour chaque dent sont faits pour les faces vestibulaires (mésial, vestibulaire, distal) et pour les faces linguales (mésial, lingual distal). Le sondage se fait avec le même praticien et la même force. La récession gingivale et l'examen dentaire sont pris en compte (formule dentaire, abrasions dentaires, mobilités dentaires, atteintes de furcation). L'examen radiographique comprend une radiographie panoramique et des radiographies rétroalvéolaires, qui sont plus précises. Cet examen confirme ou non la perte osseuse et, si elle existe, sa sévérité (débutante, moyenne, sévère), sa localisation (localisée, généralisée) et son type (horizontale, verticale, interradiculaire). Les patients recrutés présentent une parodontite chronique ou une parodontite agressive (International Workshop for a classification of periodontal diseases and conditions, 1999 ; Struillou, ²⁰⁰³) qui peut être soit localisée (moins de 30 % des sites atteints), soit généralisée (plus de 30 % de sites atteints). Le degré de sévérité (débutante ou légère, modérée, sévère) dépend de l'importance de la perte d'attache.

La parodontite chronique est caractérisée par la concordance entre les facteurs locaux et le degré de l'atteinte ainsi que par la présence de facteurs de rétention de plaque. Il n'y a pas de siège de prédilection. Le degré de sévérité de l'atteinte dépend de la quantité des facteurs locaux associés ou non à des facteurs de risque tels que le tabac ou le stress. L'évolution est lente (se référer à l'histoire de la maladie). Les signes d'inflammation sont peu importants.

Les parodontites agressives localisées sont caractérisées par :

– peu de plaque, de tartre et de caries ;

– peu ou pas d'inflammation ;

– des poches au niveau des incisives et des premières molaires des deux maxillaires ;

– la mobilité des dents atteintes ;

– une évolution rapide ;

– des lyses symétriques et en miroir au niveau des premières molaires et des incisives.

Les parodontites agressives généralisées sont caractérisées par :

– peu ou pas de plaque, peu de tartre ;

– une inflammation discrète ou sévère ;

– des poches profondes pouvant toucher toutes les dents sans siège de prédilection ;

– la présence de récessions ;

– l'absence de concordance entre les facteurs locaux et le degré de l'atteinte ;

– la présence de tartre dans les formes sévères.

Les sujets contrôle sans parodontite sont âgés moins de 38 ans, avec une profondeur au sondage inférieure à 3,5 mm, pas de récession gingivale (due à la parodontite) ni de perte d'os alvéolaire à la lecture des radiographies. Les sujets du groupe test et du groupe contrôle ne présentent aucune autre maladie générale. Après avoir reçu l'accord du sujet pour participer à l'étude, un prélèvement de sang total est effectué (10 et 5 ml) pour le génotypage HLA-DRB1.

Génotypage HLA-DRB1

L'ADN génomique est extrait à partir de sang total (de 5 à 10 ml) par la technique salting out (Miller et al., ¹⁹⁸⁸). La qualité, la quantité et la concentration de tous les ADN sont évaluées par spectrophotométrie et par électrophorèse sur gel d'agarose 1 %. Tous les ADN sont ensuite dilués à 20 ng/μl.

PCR SSO haute résolution au Luminex

Les ADN des sujets sont génotypés par PCR SSO (polymerase chain reaction sequence specific oligonucleotide) haute résolution au Luminex. Le mode opératoire décrit la procédure pour réaliser un génotypage HLA par la technique Labtype SSO (fabricant : Onelambda Inc., États-Unis; fournisseur : InGen Bio Sciences). La première étape de la manipulation est réalisée en zone pré-amplification. À partir de 2 μl d'ADN (20 ng/μl) de chaque individu, l'exon 2 du gène DRB1 est d'abord amplifié par PCR (thermocycleur 9700) en utilisant l'amorce spécifique de groupe (programme d'amplification: étape 1, 96 °C, 3 minutes, 1 cycle; étape 2: 96 °C, 20 secondes, 5 cycles, 60 °C, 20 secondes, 5 cycles, 72 °C, 20 secondes, 5 cycles ; étape 3 : 96 °C, 10 secondes, 30 cycles, 60 °C, 15 secondes, 30 cycles, 72 °C, 20 secondes, 30 cycles ; étape 4 : 72 °C, 10 minutes, 1 cycle ; étape 5 : 4 °C, infini, 1 cycle). Le contrôle d'amplification est réalisé, en zone post-amplification, à partir de 4 μl d'amplicon sur gel d'agarose 1 %. Dans la même zone, le produit PCR biotinylé est dénaturé après incubation de 10 minutes à 20 °C (2,5 μl de dénaturation buffer pour 5 μl d'ADN dans chaque puits) qui s'observe par un changement de couleur passant du rose pâle au fuchsia. Pendant ce temps, le mélange de billes (34 μl d'hybridation buffer et 4 μl Labtype SSO Bead Mix maintenus à 4 °C par puits) est préparé. Après dénaturation, le mélange est neutralisé (5 μl de neutralisation buffer par puits), un changement de couleur se produit, du fuchsia au jaune. L'ADN est ensuite hybridé aux sondes ADN complémentaires couplées aux microsphères fluorescentes ou billes (38 μl de mélange de billes préparé précédemment dans chaque puits). Un seal PCR est déposé sur la plaque, agitée sur vortex, puis rapidement incubé pendant 15 minutes à 60 °C dans le thermocycleur 9700 (programme hybride Labtype). Un lavage (100 μl de wash buffer par puits) rapide est suivi d'une centrifugation à 1 300 g pendant 5 minutes ; le surnageant est éliminé. L'opération est répétée deux autres fois. La solution SAPE (streptavidine conjuguée à la R-phycoérythrine : 49,5 μl de tampon de dilution, 0,5 μl de SAPE par puits) est ajoutée, suivie d'une incubation pendant 5 minutes à 60 °C dans le thermocycleur 9700. Le mélange est lavé (100 μl de wash buffer par puits) puis centrifugé à 1 300 g pendant 5 minutes et le surnageant est éliminé. Le produit est remis en suspension dans 80 μl de tampon de lavage, agité au vortex et transféré dans une plaque 96 puits (fond V), pour faire l'acquisition au niveau de la station Luminex. L'intensité de fluorescence de la phycoérythrine fixée sur chaque microsphère est mesurée par l'analyseur en flux LABScan™ 100. Le résultat du typage HLA est fondé sur le schéma de réactivité obtenu par comparaison avec celui qui est associé à la base de données des séquences de gènes HLA publiées. L'interprétation des résultats est ensuite validée.

Analyse statistique

Les données sont enregistrées sur Excel, divisées dans des tableaux spécifiques de contingence de la méthodologie classique d'étude. Nous avons calculé le chi carré défini par Mantel-Haenzel (chi² M-H ; p < 0,05), l'odd ratio (OR) et l'indice de confiance à 95 % (IC 95 %) de l'odd ratio. L'odd ratio détermine l'intensité de l'association: s'il est supérieur à 1, le risque de développer la maladie est particulièrement élevé pour le sujet porteur du sous-type d'allèle. La comparaison d'une association HLA-DRB1-parodontite est fondée sur la comparaison des fréquences pour chaque sous-type dans le groupe d'individus avec une parodontite par rapport à celle des témoins.

Résultats

Diagnostic clinique

L'échantillon de l'étude est composé de 65 individus dont 22 non apparentés atteints de parodontite agressive généralisée (PAG), 13 non apparentés atteints de parodontite agressive localisée (PAL), 12 non apparentés atteints de parodontite chronique (PC) et 18 sans parodontite (^tableau 1). Leur âge moyen est respectivement de 23 ans, 22 ans, 37 ans et 24 ans. Les paramètres cliniques sont l'indice de plaque, l'indice gingival et l'indice de saignement qui sont situés entre 1 et 2 chez les patients avec une parodontite. La profondeur des poches est en moyenne de 5,88 mm pour les patients avec PAG, 5,65 mm pour ceux avec PAL, 3,96 mm pour ceux avec PC et inférieure à 3 mm pour les individus sans parodontite. La majorité des sujets présentant une parodontite ou non sont de sexe féminin : 17 femmes avec une PAG, 12 avec une PAL, 9 avec une PC et 15 sans parodontite.

Nombre de chromosomes et fréquences des allèles HLA-DRB1

Dans l'échantillon global, sur 130 chromosomes n° 6, 17 portent l'allèle HLA-DRB1 * 15:01 dont la fréquence génique (FG) est de 13,07 % ; 16 chromosomes portent l'allèle HLA-DRB1 * 07:01 avec une fréquence génique de 12,30 % ; 15 chromosomes portent l'allèle HLA-DRB1 * 03:01 avec une fréquence génique de 11,53 % et 12 chromosomes portent l'allèle HLA-DRB1 * 01:02 avec une fréquence génique de 9,23 % (^tableau 2). Les fréquences les plus élevées des sujets (FS) sont, pour les allèles HLA-DRB1 * 15:01, HLA-DRB1 * 03:01, HLA-DRB1 * 07:01, HLA-DRB1 * 01:02 et HLA-DRB1 * 04:05 de respectivement 26,15 %, 23,07 %, 21,53 %, 16,92 % et 13,84 % (^tableau 2). Une homozygotie est observée pour le sous-type HLA-DRB1 * 07:01, l'un avec un phénotype PAL et l'autre sans parodontite.

Relation entre HLA-DRB1 et les patients avec une parodontite agressive localisée

Les fréquences géniques les plus élevées chez les individus de phénotype PAL sont HLA-DRB1 * 07:01, HLA-DRB1 * 15:01 et HLA-DRB1 * 11:01 et s'élèvent à 11,5 % (^tableau 3). Parmi les 13 sujets de phénotype PAL la fréquence des sujets pour ces sous-types est la même avec 23,07 %, suivie de HLA-DRB1 * 04:02 avec 15,38 % (^tableau 4).

Relation entre HLA-DRB1 et les patients avec une parodontite agressive généralisée

Chez les individus de phénotype PAG, les fréquences géniques les plus élevées sont HLA-DRB1 * 07:01, HLA-DRB1 * 15:01, de 15,55 %, suivies de HLA-DRB1 * 04:05 de 11,11 % (^tableau 3). Parmi les 22 patients de phénotype PAG (^tableau 4), la fréquence des sujets pour HLA-DRB1 * 15:01 est de 31,81 %, suivie de HLA-DRB1 * 03:01, HLA-DRB1 * 04:05 et HLA-DRB1 * 07:01 avec la même fréquence de 22,72 % et HLA-DRB1 * 01:02, HLA-DRB1 * 13:01 avec la même fréquence de 13,63 % pour chaque sous-type (^tableau 4).

Relation entre HLA-DRB1 et les patients avec une parodontite chronique

Chez les individus de phénotype PC, les fréquences géniques élevées s'observent pour HLA-DRB1 * 01:02, HLA-DRB1 * 03:01, HLA-DRB1 * 13:02 et HLA-DRB1 * 15:01, avec la même valeur de 12,5 % (^tableau 3). Les 12 sujets de phénotype PC présentent la même fréquence pour HLA-DRB1 * 15:01, HLA-DRB1 * 01:02 et HLA-DRB1 * 03:02 qui est de 25 %, suivie de HLA-DRB1 * 04:03, HLA-DRB1 * 11:01, et HLA-DRB1 * 13:02 avec la même fréquence de 16,66 % (^tableau 4).

Relation entre HLA-DRB1 et les patients sans parodontite

Pour les individus sans parodontite (SP), l'allèle le plus fréquent est HLA-DRB1 * 03:01 avec 17,14 %, suivi de HLA-DRB1 * 07:01 avec 14,28 % et de HLA-DRB1 * 01:02 et HLA-DRB1 * 15:01 avec une fréquence identique de 11,42 % (^tableau 3). Parmi les 18 individus de phénotype SP, on note une fréquence des sujets de 33,33 % pour HLA-DRB1 * 03:01, de 22,27 % pour HLA-DRB1 * 07:01 ; pour HLA-DRB1 * 01:02 et HLA-DRB1 * 15:01, la fréquence est la même, soit 22,22 % ; 16,66 % de sujets sont HLA-DRB1 * 04:05 et 11,11 % pour HLA-DRB1 * 13:02 et HLA-DRB1 * 15:02 (^tableau 4).

Comparaison des fréquences des sujets avec et sans parodontite

La comparaison des fréquences des patients avec une PAL et des sujets contrôles sans parodontite permet de constater des différences dans les fréquences pour le sous-type HLA-DRB1 * 04:02, respectivement de 15,38 % et 5,55 %. Cependant, le chi² M-H pour p < 0,05 calculé est non significatif (chi² M-H = 0,81 ; OR = 3,09 avec IC 95 % : 0,25 < OR < 38,07). Entre les patients avec une PAG et les individus sans parodontite, la différence s'observe pour HLA-DRB1 * 04:05 et HLA-DRB1 * 15:01, chi² M-H pour p < 0,05 étant non significatif (^tableau 5). Pour celle entre PC et SP, on retient HLA-DRB1 * 04:03 et HLA-DRB1 * 15:01. Cependant, le chi² M-H pour p < 0,05 est inférieur à 3,84 (^tableau 5).

Discussion

Dans cette étude, nous avons pris connaissance de la robustesse de la technologie Luminex en réalisant le typage HLA-DRB1 sur 65 individus avec ou sans parodontite. La distribution des allèles du gène HLA-DRB1 au sein de la population algérienne a déjà fait l'objet de plusieurs travaux (Djoulah et al., ¹⁹⁹² ; Benhamamouch et al., ¹⁹⁹⁷ ; Hors et al., ¹⁹⁹⁷ ; Boudjema et al., ²⁰⁰³). Ils montrent que les allèles les plus fréquents dans la population algérienne sans aucune pathologie sont HLA-DRB1 * 03:01 et HLA-DRB1 * 07:01 : 15,2 et 13,6 %, respectivement (Benhamamouch et al., ¹⁹⁹⁷). Dans notre groupe d'individus sans aucune pathologie et sans parodontite, ces fréquences sont également élevées: 17,14 et 14,28 % respectivement (^tableau 2). En revanche, HLA-DRB1 * 15:01 est de basse fréquence, soit 3 %, par rapport à celle observée dans notre groupe SP qui est de 11,42 %. Nous supposons que cela est dû au fait que notre groupe témoin est petit. Parmi les sous-types de susceptibilité à la parodontite à progression rapide correspondant à une PAG, cités dans la littérature scientifique, nous avons HLA-DRB1 * 04:01/04:04/04:05/04:08 (Bonfil et al., ¹⁹⁹⁷), retrouvé dans la population de Marseille (sud de la France). Dans notre étude, parmi les allèles les plus fréquents chez les sujets de phénotype PAG figure le sous-type 04:05 ; cependant, le chi² M-H calculé est non significatif. Un autre sous-type de susceptibilité à la parodontite chronique est retrouvé dans la population chinoise : HLA-DRB1 * 15:01 (Zhang et al., ²⁰⁰⁴). Dans notre groupe d'étude, ce sous-type est en effet de fréquence élevée chez les sujets PAG, PC et PAL, respectivement de 31,81, 25,00 et 23,07 %, mais également chez les sujets sans parodontite (22,22 %). D'autres sous-types sont également plus fréquents dans le groupe avec parodontite par rapport au groupe témoin, cependant sans signification statistique. Stein et al. ont travaillé sur différents loci des deux systèmes HLA, classes I et II, et ils ont observé des associations variables, rendant difficile l'attribution d'un seul marqueur à la maladie parodontale (Stein et al., ²⁰⁰³). L'association d'haplotypes peut être une avancée importante pour des loci de gènes inconnus représentant une part génétique de fond à la parodontite. La recherche sur un échantillon de 24 Japonais avec une parodontite agressive, en association avec les loci HLA-DRB1 et HLA-DQ, suggère que la molécule HLA-DQB1 joue un rôle crucial dans la pathogenèse de la pathologie et que la susceptibilité à la parodontite peut être déterminée par la capacité d'agglutination entre le peptide et les molécules HLA-DQ (Ohyama et al., ¹⁹⁹⁶). Plusieurs autres gènes ont fait l'objet de recherches d'association avec la parodontite (Yoshie et al., ²⁰⁰⁵), tels que ceux des cytokines IL1 (López et al., ²⁰⁰⁵ ; Grigoriadou et al., ²⁰¹⁰) et IL6 (Nibali et al., ²⁰⁰⁸), des récepteurs Fcγ et vitamine D (Yoshihara et al., ²⁰⁰¹), et d'identification des marqueurs d'évaluation du risque à la parodontite chronique sur le chromosome 19 (Tabeta et al., ²⁰⁰⁹).

Conclusion

Notre étude de type « cas-témoins » d'un échantillon composé de 22 patients de phénotype PAG, de 13 sujets de phénotype PAL, de 12 sujets de phénotype PC et de 18 sujets sans parodontite a permis d'observer différents génotypes HLA-DRB1 par PCR SSO Luminex haute résolution. Au niveau de ce locus, 26 allèles sont détectés. La différence dans les fréquences des sujets avec ou sans parodontie pour les sous-types HLA-DRB1 est statistiquement insignifiante est ne permet pas de déduire qu'un allèle est associé à une forme de parodontite. Cependant, nous pouvons constater déjà qu'il serait probablement difficile d'attribuer cette association à un seul allèle ou à un groupe d'allèles même si nous augmentions le nombre de patients car nous savons que la réponse immunitaire vis-à-vis du facteur infectieux dépend du patrimoine immunogénétique de l'hôte, ce qui a été démontré par les différentes recherches. En effet les gènes de susceptibilité sont très divers. Si on ajoute à cela l'effet de l'environnement, différents phénotypes sont observés donnant des diagnostics différents d'un sujet à l'autre. Il serait judicieux de connaître le profil génotypique des individus développant une parodontite non seulement au niveau du système HLA mais aussi pour d'autres gènes afin d'essayer de trouver les profils les plus prédisposés à la parodontite au sein de notre population d'étude.

Remerciements

Ce travail a été réalisé dans le cadre d'un projet de recherche national agréé par la Commission Nationale d'Evaluation et de Prospective de la Recherche Universitaire (CNEPRU).

Conflit d'intérêts

Les auteurs ont indiqué n'avoir aucun conflit d'intérêts concernant cet article.

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