Étude in vitro de la variation de la sensibilité aux antibiotiques des bactéries parodontopathogènesIn vitro study of susceptibility variation in antibiotics of pathogenic periodontal bacteria

Introduction

Les parodontites sont des maladies infectieuses d’origine bactérienne, caractérisées par la destruction des tissus de soutien des dents. Les lésions parodontales peuvent être localisées sur quelques dents ou généralisées. La flore bactérienne associée aux parodontites est une flore complexe, dominée par des bacilles à Gram négatif, anaérobies strictes et/ou capnophiles. Les bactéries anaérobies telles que Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum, Peptostreptococcus micros, Capnocytophaga ochracea, Campylobacter rectus et Tanarella forsythus sont fortement impliquées dans les parodontites.

L’antibiothérapie est indispensable dans le traitement des parodontites agressives, des parodontites associées aux maladies systémiques et des parodontites chroniques réfractaires au traitement conventionnel (curetage-surfaçage radiculaire). Cependant, l’usage fréquent des antibiotiques a conduit à l’émergence de souches bactériennes résistantes (Monnet, ²⁰⁰⁰ ; Thomas, ²⁰⁰³). Plusieurs travaux ont montré le manque de sensibilité des bactéries parodontopathogènes aux antibiotiques (Feres et al., ²⁰⁰² ; Kamagaté et al., ²⁰⁰¹ ; Lakhssassi et al., ²⁰⁰⁵ ; Lakhssassi et Sixou, ²⁰⁰⁵ ; Larsen, ²⁰⁰² ; Walker ¹⁹⁹⁶ ; Walker et al., ¹⁹⁸³). Les parodontistes utilisent de plus en plus une association d’antibiotiques afin d’éradiquer efficacement les bactéries parodontopathogènes (Dubreuil, ¹⁹⁹⁵ ; Gordon et Walker, ¹⁹⁹³ ; Guerrero et al., ²⁰⁰⁵ ; Koné et Kamagaté, ²⁰⁰⁵ ; Magnusson et al., ¹⁹⁸⁹ ; Rooney et al., ²⁰⁰² ; Van Winkelhoff et al., ¹⁹⁹² ; Winkel et al., ¹⁹⁹⁸, ¹⁹⁹⁹). Au cours du traitement antibiotique, la nature des bactéries résistantes change et de nouvelles espèces bactériennes résistantes sont sélectionnées ou créées (Feres et al., ²⁰⁰²). La sensibilité des bactéries est extrêmement variable, elle dépend non seulement des espèces bactériennes mais aussi et certainement des antibiotiques.

L’objectif de ce travail est d’étudier la variation de la sensibilité de 25 bactéries parodontopathogènes vis-à-vis de 5 antibiotiques couramment utilisés en parodontie par la technique de diffusion en gélose.

Matériel et méthode

Matériels

Ont été testés les antibiotiques suivants : l’ampicilline (AMP), l’amoxicilline (AMX), la tétracycline (TET), l’érythromycine (ERY) et le métronidazole (MET).

Ils se présentent sous la forme de disques de papier buvard imprégnés des différentes molécules à des concentrations connues (Sanofi® Diagnostics Pasteur, Marnes-la-Coquette). Les disques d’antibiotiques sont dans des cartouches prêtes pour l’antibiogramme par la technique de diffusion en gélose.

L’étude a porté sur les bactéries suivantes : Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum, Campylobacter rectus et Peptostreptococcus micros. Vingt-cinq souches bactériennes, dont 5 bactéries par espèce bactérienne, ont été testées.

Ces bactéries sont des souches cliniques anaérobies strictes ou micro-aérophiles, isolées chez 10 patients atteints de parodontite évolutive (parodontites agressives et parodontites chroniques réfractaires au traitement conventionnel), au Groupement de recherche en épidémiologie des maladies infectieuses (GREMI) de la faculté de chirurgie dentaire de Toulouse. Aucun des patients n’avait utilisé d’antibiotiques dans les 6 mois précédant l’expérience, ils étaient tous en bonne santé sur le plan général et non fumeurs.

Les prélèvements sont effectués avec des pointes de papier stériles sur des sites présentant des profondeurs de poches supérieures à 6 mm avec une preuve de destruction osseuse sur le plan radiographique. Ils sont faits après élimination des dépôts bactériens et tartriques supra-gingivaux. On utilise le VGMA-III comme milieu de transport. C’est un milieu semi-gélosé qui préserve les bactéries de l’oxygène de l’air. La présence d’éléments bactériostatiques dans sa composition permet de maintenir le rapport de chacune des populations bactériennes dans le prélèvement.

Dès que les prélèvements arrivent au laboratoire, une série de dilutions dans du bouillon Wilkins-Chalgren® (WC®), à partir des flacons de 2 ml de milieu de transport, est réalisée. Les prélèvements sont ensuite ensemencés sur des milieux de culture sélectifs et non sélectifs enrichis (0,5 % de sang de mouton stérile, 0,000 2 % de menadione et 0,4 % d’hémine) et placés dans des conditions d’anaérobiose à 37°C pendant 5 jours.

Les tests d’identification des souches cliniques sont fondés sur les critères du Bergey’s manuel (Holt, ¹⁹⁹⁴) : morphologie des colonies, fluorescence à l’exposition aux rayons UV, coloration de Gram, méthode au KOH (hydroxyde de potassium), mobilité (microscope à fond noir), tests biochimiques et enzymatiques, galerie d’identification biochimique API 20A, galerie d’identification enzymatique Rapid 32, métabolisme respiratoire (aéro-anaérobie, anaérobie stricte…). La sensibilité aux antibiotiques a été évaluée à partir de cultures pures et 25 espèces bactériennes dont 2 ou 3 espèces par site et par patients, ont été sélectionnées.

Méthode

La méthode de diffusion en gélose a été utilisée. L’antibiogramme par la technique de diffusion en gélose consiste à déposer à la surface d’une gélose WC® ou d’une gélose WC® enrichie au sang des disques de papier buvard imprégnés des différents antibiotiques, à des concentrations connues. Les cartouches de disques de papier buvard imprégnés sont montées sur un distributeur automatique qui dépose les disques en respectant une distance de 24 mm entre chacun d’eux. L’antibiotique diffuse de manière uniforme au sein de la gélose si bien que sa concentration est inversement proportionnelle à la distance du disque. Les boîtes de Petri doivent être parfaitement sèches et les géloses ont une épaisseur de 4 mm. Avant de déposer les disques, on ensemence uniformément la surface de la gélose avec le micro-organisme à étudier. L’inoculum doit être dense. Cette densité est ajustée par comparaison avec un étalon opacité (0,5 sur l’échelle de Mac Farland). La suspension bactérienne contient environ 10⁸ bactéries par millilitre.

Après une incubation de 24 à 72 heures en anaérobiose à 37°C, une zone circulaire d’inhibition correspondant à une absence de culture apparaît autour des disques. À la limite des zones d’inhibition, il existe dans la gélose des concentrations d’antibiotique égales aux concentrations minimales inhibitrices (CMI). La méthode de diffusion ne permet pas de chiffrer directement ces valeurs. Toutefois, il existe une relation simple entre les diamètres des zones d’inhibition et les log2 des CMI mesurées par les techniques de dilution. Ces relations, appelées droites de régression ou courbe de concordance, ont été établies par le laboratoire spécialisé (Sanofi® Diagnostics Pasteur). Les mesures des diamètres d’inhibition et leur report sur les courbes de concordance donnent les valeurs des CMI en mg/ml. Les résultats sont exprimés en souche sensible, intermédiaire ou résistante.

L’antibiogramme par la technique de diffusion en milieu gélosé est une méthode de choix en bactériologie clinique, en raison de sa simplicité, de sa rapidité et de sa facilité de réalisation (Kamagaté et al., ²⁰⁰¹ ; Sixou, ²⁰⁰³). C’est une technique qui est utilisée en routine au GREMI et un contrôle de qualité est régulièrement réalisé. Tous les mois, le laboratoire vérifie la validité de la technique en testant plusieurs souches de référence afin de vérifier que les diamètres des zones d’inhibition obtenues vis-à-vis des divers antibiotiques sont conformes aux valeurs publiées par le comité de l’antibiogramme de la Société française de microbiologie.

Analyse statistique

Les données recueillies ont été transférées dans Microsoft Office 2007, application Excel. Les moyennes des diamètres d’inhibition des 25 espèces bactériennes en fonction des 5 antibiotiques ont été calculées. Le coefficient de variation de la sensibilité pour chaque antibiotique a également été déterminé. Le test de Student a été utilisé pour les comparaisons statistiques. L’écart type a été déterminé ainsi que la valeur de p qui a été considéré statistiquement significative s’il était inférieur à 0,05.

Résultats

L’activité antibactérienne des 5 antibiotiques vis-à-vis des bactéries étudiées est reportée dans le ^{tableau 1}. Une analyse globale des diamètres d’inhibition montre que les antibiotiques les plus efficaces sont représentés, dans l’ordre, par l’amoxicilline et l’ampicilline puis par la tétracycline. L’érythromycine a une action intermédiaire et le métronidazole s’est montré inefficace. Les bêta-lactamines se sont montrées efficaces sur l’ensemble des espèces bactériennes avec 84 % de souches sensibles, 8 % de souches intermédiaires et 8 % de souches résistantes. Pour la tétracycline, on constate 76 % de souches sensibles, 8 % de souches intermédiaires et 16 % de souches résistantes. Pour l’érythromycine, il y a 56 % de souches sensibles, 20 % de souches intermédiaires et 24 % de souches résistantes. Enfin, pour le métronidazole, il s’agit de 28 % de souches sensibles, 24 % de souches intermédiaires et 48 % de souches résistantes. L’espèce bactérienne la plus sensible a été C. rectus, avec une moyenne des moyennes des diamètres d’inhibition de 25,44 mm, et les moins sensibles ont été P. micros, avec une moyenne des moyennes des diamètres d’inhibition de 16,88 mm, et F. nucleatum avec 17,44 mm (^{tableau 2}).

Le calcul des moyennes des diamètres d’inhibition a permis de réaliser les histogrammes des moyennes (^fig. 1 et ²). L’écart type et le coefficient de variation de la sensibilité de chaque antibiotique sont indiqués dans le ^{tableau 2}. Le test de Student donne des valeurs de p < 0,05, donc la variation de la sensibilité des différentes espèces bactériennes est statistiquement significative pour les 5 antibiotiques testés.

Discussion

La majorité des espèces bactériennes testées ont été sensibles à l’ampicilline et à l’amoxicilline, ce qui est en accord avec divers travaux (Feres et al., ²⁰⁰² ; Kinder et al., ¹⁹⁸⁶ ; Lakhssassi et al., ²⁰⁰⁵ ; Lakhssassi et Sixou, ²⁰⁰⁵). Ces travaux ont montré que la grande majorité des espèces bactériennes isolées dans la flore sous-gingivale des patients atteints de parodontite agressive était sensible à l’amoxicilline. L’idée selon laquelle Prevotella intermedia est une espèce résistante à l’amoxicilline vient du fait que cette bactérie est productrice de bêta-lactamase (Dubreuil et al., ¹⁹⁹⁵ ; Van Winkelhoff et al., ¹⁹⁹⁷). Dans cette étude, seule la souche n° 2 de P. intermedia et les souches n° 4 et 5 de F. nucleatum se sont montrées résistantes aux bêta-lactamines (ampicilline, amoxicilline). Ces 3 souches amoxicilline résistantes se sont montrées sensibles à la tétracycline qui, cependant, a un taux de souches résistantes plus élevé que l’amoxicilline.

Quarante-huit pour cent des espèces bactériennes se sont montrées résistantes au métronidazole. Ce résultat est en accord avec le travail de Feres et al. qui a montré que 50 % des isolats étaient résistants au métronidazole avant le traitement (Feres et al., ²⁰⁰²). Walker et al. ont étudié l’action inhibitrice de divers antibiotiques sur des bactéries isolées chez des patients atteints de parodontite modérée ou sévère (Walker et al., ¹⁹⁸³). Ils ont comparé le nombre de bactéries comptées sur les milieux de culture contenant les antibiotiques et celui de bactéries comptées sur les milieux de culture sans antibiotique. Le résultat a montré que 30 % des bactéries étaient résistantes au métronidazole. Le faible pourcentage de bactéries résistantes était dû au fait que la concentration de métronidazole était légèrement plus élevée dans le milieu de culture, environ 8 mg/ml, alors que dans l’étude de Feres et al., elle était de 2 mg/ml (Feres et al., ²⁰⁰²). Toutefois, dans cette étude, le métronidazole a été légèrement plus efficace sur F. nucleatum par rapport à l’amoxicilline et à l’ampicilline, avec une moyenne des diamètres d’inhibition de 17,6 mm pour le métronidazole contre 17,4 mm pour l’ampicilline et 17 mm pour l’amoxicilline. Seule la tétracycline a été plus efficace sur l’espèce F. nucleatum avec une moyenne des diamètres d’inhibition de 22,2 mm.

Seulement 56 % des espèces bactériennes étaient sensibles à l’érythromycine avec un coefficient de variation de 34 %. Ce résultat est en accord avec les travaux de Lakhssassi et al. qui ont montré que seules 54 % des bactéries isolées chez des patients atteints de parodontite agressive étaient sensibles à l’érythromycine avec un coefficient de variation de 53 % (Lakhssassi et al., ²⁰⁰⁵ ; Lakhssassi et Sixou, ²⁰⁰⁵). Même si la valeur du coefficient de variation est plus élevée dans leur étude, l’érythromycine possède le coefficient de variation le plus élevé des antibiotiques testés dans les deux travaux. Les antibiotiques les plus efficaces ont montré les plus faibles coefficients de variation (19,58 % pour l’amoxicilline, 20,45 % pour l’ampicilline et 20,66 % pour la tétracycline). Cela signifie que même si la variation de la sensibilité est statistiquement significative (p < 0,05), la résistance au sein de ces antibiotiques est stable et régulière (Lakhssassi et Sixou, ²⁰⁰⁵). De même, le métronidazole s’est montré inefficace avec un coefficient de variation peu élevé (26,64 %). La résistance au niveau de l’érythromycine est instable et irrégulière parce que cet antibiotique intermédiaire a un coefficient de variation plus élevé (Lakhssassi et al., ²⁰⁰⁵ ; Lakhssassi et Sixou, ²⁰⁰⁵). L’utilisation de cet antibiotique dans le traitement des parodontites agressives peut augmenter le risque d’échec, sauf s’il est utilisé en association. Toutefois, la complexité de la flore bactérienne impliquée dans les parodontites sévères ou agressives associée à la variabilité de la sensibilité des bactéries fait que la combinaison des antibiotiques est recommandée dans le traitement de ces affections. D’ailleurs, plusieurs travaux ont montré l’efficacité de l’association des antibiotiques dans le traitement des parodontites agressives (Gordon et Walker, ¹⁹⁹³ ; Guerrero et al., ²⁰⁰⁵ ; Kamagaté et al., ²⁰⁰¹ ; Magnusson et al., ¹⁹⁸⁹ ; Rooney et al., ²⁰⁰² ; Slots et Ting, ²⁰⁰² ; Van Winkelhoff et al., ¹⁹⁹² ; Winkel et al., ¹⁹⁹⁸, ¹⁹⁹⁹).

Conclusion

Les antibiotiques les plus efficaces ont montré les plus faibles coefficients de variation ; toutefois, les variations ont été statistiquement significatives pour les 5 antibiotiques testés. Le faible pourcentage du coefficient de variation montre que la résistance au sein de ces antibiotiques est stable et régulière par rapport aux antibiotiques qui ont des coefficients de variation élevés. Il est difficile d’extrapoler les études in vitro aux études in vivo. Cependant, les indications sur la susceptibilité des bactéries aux agents antibactériens sont obtenues en comparant les concentrations minimales inhibitrices in vitro et les concentrations des antibiotiques qui peuvent atteindre le site d’infection. L’antibiotique actif in vitro a-t-il une chance d’être efficace in vivo compte tenu du contexte clinique ? D’autres considérations cliniques (la complexité de la flore, l’action du biofilm), pharmacologiques, toxicologiques et financières sont à prendre en compte dans le choix d’un traitement antibiotique (Addy et Martin, ²⁰⁰³ ; Eick et al., ²⁰⁰⁴ ; Høiby et al., ²⁰¹⁰ ; Walker et al., ¹⁹⁸³ ; Winkel et al., ¹⁹⁹⁹). L’antibiogramme n’est alors qu’un des éléments permettant d’instaurer une antibiothérapie.

Enfin, d’autres recherches doivent être menées avec un échantillon de bactéries plus important afin de corroborer les résultats présentés ici. Surtout, il convient d’étendre les recherches à d’autres antibiotiques et à d’autres espèces bactériennes telles que Tannerella forsythia, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Capnocytophaga ochracea et Eikenella corrodens.

BIBLIOGRAPHIE

• Addy M, Martin MV. Systemic antimicrobials in the treatment of chronic periodontal disease: a dilemma. Oral Dis 2003;9 (suppl. 1):38-44.
• Dubreuil L. Anaérobies stricts : bilan de sensibilité à l’association amoxicilline-acide clavulanique. État de la résistance aux antibiotiques. Lettre Infectiolog 1995;hors-série:13-19.
• Dubreuil L, Senneville E, Linez M. Critères de choix d’un antibiotique dans les infections parodontales. Rôle des anaérobies stricts et de la production de b-lactamase. J Parodontol 1995;14:65-74.
• Eick S, Seltman T, Pfister W. Efficacy of antibiotic to strains of periodonto-pathogenic bacteria species biofilm. An in vitro study. J Clin Periodontal 2004;31:376-383.
• Feres M, Haffajjee AD, Allard K, Som S, Goodson S, Socransky SS. Antibiotic resistance of subgingival species during and after antibiotic therapy. J Clin Periodontol 2002;29:724-735.
• Gordon JM, Walker CB. Current status of systemic antibiotic usage in destructive periodontal disease. J Periodontol 1993;64:760-771.
• Guerrero A, Griffiths GS, Nibali L, Suvan J, Moles DR, Laurell L et al. Adjunctive benefits of systemic amoxicillin and metronidazole in non-surgical treatment of generalized aggressive periodontitis: a randomized placebo-controlled clinical trial. J Clin Periodontol 2005;32:1096-1107.
• Høiby N, Bjarnsholt T, Givskov M, Molin S, Coifu O. Antibiotic resistance of bacterial biofilm. Int J Antimicrob Agents 2010;35:322-332.
• Holt JG. Bergey’s manual of determinative bacteriology. Baltimore: William and Wilkins, 1994.
• Kamagaté A, Koné D, Coulibaly NT, Brou E, Sixou M. Étude comparative de différentes méthodes d’évaluation de la sensibilité aux antibiotiques des bactéries anaérobies strictes de la flore sous-gingivale. Odonto Stomatol Trop 2001;95:9-12.
• Koné D, Kamagaté A. Étude comparative de deux formes d’association des antibiotiques dans le traitement des PPR. Odonto Stomatol Trop 2005;110:41-44.
• Kinder SA, Holt SC, Korman KS. Penicillin resistance in the subgingival microbiota associated with adult periodontitis. J Clin Periodontol 1986;23:1127-1133.
• Lakhssassi N, Sixou M. Efficacy variation of erythromycin and spiramycin on periopathogens in aggressive periodontitis. An in vitro comparative study. Pathol Biol 2005;53:527-535.
• Lakhssassi N, Elhajoui N, Lodter JP, Pineill JL, Sixou M. Antimicrobial susceptibility. Variation of 50 anaerobic periopathogens in aggressive periodontitis: an interindividual variability study. Oral Microbiol Immunol 2005;20:244-252.
• Larsen T. Susceptibility of Porphyromonas gingivalis in biofilms to amoxicillin, doxycycline and metronidazole. Oral Microbiol Immunol 2002;17:267-271.
• Magnusson I, Clark WB, Low SB, Mariuniak J, Marks RG, Walker CB. Effect of non-surgical periodontal therapy combined with adjunctive antibiotics in subjects with « refractory » periodontal desease (I). Clinical results. J Clin Periodontol 1989;16:647-653.
• Monnet DL. Consommation d’antibiotiques et résistance bactérienne. Ann Fr Anesth Reanim 2000;19:409-417.
• Rooney J, Wade WG, Sprague SV, Newcombe RG, Addy M. Adjunctive effects to non-surgical periodontal therapy of systemic metronidazole and amoxicillin alone and combined. A placebo controlled study. J Clin Periodontol 2002;29:342-350.
• Sixou M. Diagnostic testing as a supportive measure of treatment strategy. Oral Dis 2003;19:16-21.
• Slots J, Ting M. Systemic antibiotics in the treatment of periodontal desease. Periodontol 2000 2002;28:106-176.
• Slots J, Van Winkelhoff AJ. Antimicrobial therapy in periodontics. J Calif Dent Assoc 1993;21: 51-56.
• Thomas JP. Antibiotic resistance. Dent Clin North Am 2003;47:623-639.
• Van Winkelhoff AJ, Tijhof CJ, De Graaff J. Microbiological and clinical results of metronidazole plus amoxicillin therapy in Actinobacillus actinomycetemcomitans-associated periodontitis. J Periodontol 1992;63:52-57.
• Van Winkelhoff AJ, Winkel EG, Barendregt DS, Dellemijn-Kippuw N, Van der velden U. Beta-lactamase producting bacteria in adult periodontitis. J Clin Periodontol 1997;24:538-543.
• Walker CB. Acquisition of antibiotic resistance in the periodontal microflora. Periodontol 2000 1996;10:79-88.
• Walker CB, Gordon JM, Socransky SS. Antibiotic susceptibility testing of subgingival plaque samples. J Clin Periodontol 1983;10:422-432.
• Wilson M. Susceptibility of oral bacterial biofilms to antimicrobial agents. J Med Microbiol 1996;44:76-87.
• Winkel EG, Van Winkelhoff AJ, Van der velden U. Additional clinical and microbiological effects of amoxicillin and metronidazole after initial periodontal therapy. J Clin Periodontol 1998;25:857-864.
• Winkel EG, Van Winkelhoff AJ, Barendregt DS, Van der Weijden GA, Timmerman MF, Van der Velden U. Clinical and microbiological effects of initial periodontal therapy in conjunction with amoxicillin and clavulanic acid in patients with adult controlled study. J Clin Periodontol 1999;26:461-468.
• Zaura-arite E, Van Marle J, Ten Cate JM. Confocal microscopy study of undisturbed and chlorhexidine treated dental biofilm. J Dent Res 2001;80:1436-1440.