Analyse histologique qualitative de la réponse osseuse à une hydroxyapatite optimisée Étude préliminaireQualitative evaluation of the histological bone response to an optimized hydroxyapatite A preliminary study

Introduction

Les techniques de régénération ­osseuse utilisant des biomatériaux sont largement utilisées pour augmenter la quantité et la qualité de l’os. Cette augmentation est délicate dans les zones où l’insuffisance d’os empêche la stabilisation mécanique des implants ou encore lors du traitement de défauts parodontaux intra-osseux. Tous les biomatériaux devraient être ostéogéniques, ostéo-inducteurs et/ou ostéoconducteurs, et devraient se résorber progressivement pour être remplacés par de l’os néoformé (Giannoudis et Tsiridis, ²⁰⁰⁵). En ce qui concerne leur capacité à stimuler le tissu osseux, les biomatériaux peuvent être classés comme étant :

– bioactifs lorsqu’ils stimulent la formation de tissu osseux en établissant un interface os/biomatériau unique ;

– bio-inertes lorsqu’ils ne stimulent que la formation de tissu fibreux en établissant un interface os/biomatériau faible (LeGeros, ²⁰⁰⁸ ; Daculsi et al., ¹⁹⁹⁰).

Parmi tout les biomatériaux disponibles, l’autogreffe est considérée comme étant le matériau idéal pour les techniques de greffes parce qu’il concentre les facteurs de croissance ostéo-inducteurs, les cellules ostéogénique et permet également un échafaudage ostéoconducteur. Cependant, les limites rencontrées en termes de quantité de greffe disponible et de morbidité du site donneur ont encouragé les recherches vers d’autres substituts d’os possibles.

La mise au point des biomatériaux à base de phosphate de calcium (PCa) est fondée sur la similitude de sa composition avec celle de l’os minéral (Martins, ²⁰⁰⁹ ; Aoki, ¹⁹⁹⁴ ; De Groot, ¹⁹⁸³ ; Jarcho, ¹⁹⁸¹), ce qui leur confère des propriétés telles que la biodégradation, la bioactivité et l’ostéoconductivité. Avec l’intensification des recherches sur les matériaux biorésorbables, bioactifs et analogues à l’os, l’intérêt s’est largement orienté vers la synthèse d’apatites biomimétiques, par exemple les hydroxyapatites (HA) (Celotti et al., ²⁰⁰⁶).

L’hydroxyapatite est le composant inorganique principal de la matrice osseuse et a été le premier matériau à être synthétisé et fabriqué de façon spécifique afin d’être utilisé comme substitut osseux.

La possibilité d’améliorer la réponse biologique à une HA synthétique peut être obtenue, par exemple, en contrôlant la taille des cristaux de l’apatite synthétique. L’activité ostéo­clastique sur l’hydroxyapatite synthétique semble dépendre des caractéristiques intrinsèques de ce biomatériau. Parmi ces caractéristiques, la taille (microcristalline et nanocristalline) et la forme du cristal, ainsi que leur faible organisation peuvent promouvoir le processus de résorption (Constantz et al., ¹⁹⁹⁵ ; Muller-Mai et al., ¹⁹⁹⁵).

Le but de cette étude est d’analyser la performance biologique d’une nouvelle hydroxyapatite synthétique, en utilisant un modèle de lapin avec une cicatrisation osseuse différée sur des défauts crâniens de faible capacité rétentrice.

Matériel et méthode

Six lapins blancs mâles de Nouvelle-Zélande (Oryctolagus cuniculus), pesant 3,4 ± 0,5 kg, sont divisés en deux groupes égaux (groupe 1 et groupe 2), correspondant chacun à une période expérimentale bien définie (2 et 4 semaines, respectivement). Ils reçoivent un régime alimentaire standard et sont autorisés à boire à volonté. Le protocole est dûment approuvé par les législations nationales et internationales.

L’anesthésie est pratiquée avec de la médétomidine (0,15 mg/kg par voie sous-cutanée) et du butorphanol (0,1 mg/kg par voie intramusculaire). Après avoir administré de la kétamine (5 mg/kg par voie intramusculaire), l’anesthésie est maintenue par une inhalation d’isoflurane (0,25-2 %). Le monitorage est maintenu durant toute la phase chirurgicale.

Le modèle de cicatrisation osseuse différée est réalisé en créant 2 défauts osseux circonférentiels (de 8 mm chacun), un sur chaque os pariétal. Après trichotomie, on réalise une incision sagittale de pleine épaisseur le long de la suture médiane du crâne. Le périoste est déplacé avec soin (^{fig. 1}). La trépanation de chaque os pariétal est effectuée à l’aide d’une tréphine sous irrigation constante de sérum physiologique. La craniotomie est réalisée en enlevant l’os crânien interne et externe sans léser la dure-mère ni le sinus sagittal (^{fig. 2} et ³). Pour chacun des groupes, 5 défauts sont comblés avec de l’hydroxyapatite nanocristalline (HA (groupe témoin) (^{fig. 4}) et 1 défaut est laissé vide (témoin négatif). Le périoste et la peau sont respectivement suturés avec une suture résorbable 4.0 (Coated ­Vicryl® 4.0, Ethicon, Édimbourg, Royaume-Uni) et un fil de soie 3.0 (Perma Sharp™, soie noire tressée 3.0, Hu-Friedy Co., Chicago, États-Unis). Après l’intervention, les animaux reçoivent une seule dose intramusculaire de méthylprednisolone (8 mg/kg) et d’enrofloxacine (5 mg/kg par voie sous-cutanée, b.i.d.) durant la première semaine. Au bout de 2 semaines (groupe 1) et 4 semaines (groupe 2), les animaux sont sacrifiés à l’aide d’une dose de sodium de pentobarbital (1 ml/kg).

L’hydroxyapatite testée dans cette étude provient du mélange, à parts égales, de 2 grains d’hydroxyapatite : l’un synthétisé à 500 °C et l’autre à 800 °C, avec des nanocristaux (< 100 nm) orientés de façon irrégulière.

La taille des cristaux est déterminée par diffraction aux rayons X. Le rapport calcium/phosphore (Ca/P) est de 1,67 (Gomes et al., ²⁰⁰⁸). Tous les échantillons sont préparés en technique non décalcifiée, selon le protocole du Pr Donath (Donath et Breuner, ¹⁹⁸² ; Donath, ¹⁹⁹⁵) et le système de haute précision Exakt® (Apparatebau, GmbH & CO, Norderstedt, Hambourg, Allemagne). Chaque échantillon est fixé par immersion dans une solution de formaline à 10 % tout de suite après son prélèvement. Après fixation, ils sont tous déshydratés dans des grades croissants d’alcool éthylé de 60 à 100 %. Ils sont ensuite soumis à une infiltration de résine dans un appareil à agitation continue. Puis ils sont inclus dans un polymère de méthacrylate de méthyle photopolymérisé et laissés à polymériser. Les coupes par usure sont obtenues en coupant les échantillons à grande vitesse, sous spray refroidissant à l’aide de la scie coupante du système Exakt®. Deux coupes par usure sont obtenues à partir du défaut crânien : l’une coronaire, au milieu du défaut, et l’autre transversale, dans la moitié restante. Trois coupes d’usure transversales sont obtenues à partir du défaut crânien, dans les tiers externe, médian et interne du défaut. Les échantillons définitifs sont montés sur des lames d’acrylique, usés jusqu’à environ 50 µm et colorés au bleu de toluidine.

L’analyse histologique qualitative est fondée sur le processus de cicatrisation osseuse, les profils morphologiques des éléments cellulaires et les caractéristiques de l’interface os/matériau, ainsi que sur la réponse inflammatoire. Elle a été réalisée à l’aide d’un microscope optique (Nikon® Eclipse 600, Japon) à des grossissements × 40 (images à l’échelle 500 µm), × 100 (images à l’échelle 250 µm) et × 200 (images à l’échelle 500 µm).

Résultats

Après l’intervention chirurgicale, tous les animaux se sont bien remis de l’anesthésie. Ils ont été maintenus sous la surveillance de l’équipe vétérinaire durant la période expérimentale afin de s’assurer de leur bien-être.

Durant la période expérimentale, aucun signe d’inflammation n’a été détecté à l’échelle macroscopique dans la zone chirurgicale.

Défauts non comblés (témoin négatif)

Au bout de 2 semaines, l’effondrement des tissus mous est visible dans la zone du défaut, en particulier en son milieu. Le tissu osseux natif est nettement différent du tissu osseux néoformé. À la périphérie du défaut, on peut observer un cône d’os néoformé avec une croissance centripète. Quelques centres d’ossification ont été détectés au milieu du défaut, avec une forme circulaire ou ovoïde, surtout près de l’endocrâne (^{fig. 5}). La présence de plusieurs cônes coupants a pu être observée au bord du défaut. Malgré la présence de zones marginales de tissu osseux immature, le tissu conjonctif fibreux est prédominant. Au niveau des larges espaces situés entre les trabécules d’os nouveau, on note la présence de tissu conjonctif et de vaisseaux sanguins.

Au bout de 4 semaines, le cône à croissance osseuse centripète est plus gros que celui observé à 2 semaines (^{fig. 6}). Au bord du défaut, les trabécules osseuses contiennent une quantité minime de tissu osseux immature et une quantité plus importante de tissu osseux lamellaire. La présence de moelle osseuse entre les trabécules osseuses est évidente.

Défauts comblés avec de l’HAn

Au bout de 2 semaines, la présence de particules d’HAn est visible avec des formes et des dimensions très variables (^{fig. 7} et ⁸). Ces particules sont entourées de plusieurs cellules, de type ostéoclastique, liées à la fragmentation des particules. On peut voir des zones festonnées, semblables à des lacunes d’Howship, à leur surface. On observe la présence de tissu osseux néoformé dans presque toutes les zones du défaut osseux, à la fois au centre et sur les bords, mais avec des aspects histologiques très différents. Les trabécules présents au bord du défaut sont constitués d’os immature et d’un peu d’os lamellaire. De dimensions très homogènes, ils ont établi un réseau uniforme tapissant et reliant les particules entre elles et avec les bords du défaut (^{fig. 8}). À proximité ou au centre du défaut, les trabécules osseuses ont établi plusieurs connexions entre les particules enrobées (^{fig. 7}) et sont séparés par des espaces remplis d’un tissu conjonctif hautement vascularisé. Parfois, on peut observer le début du processus de minéralisation dans la matrice ostéoïde. Sur le bord des particules, on note également la présence d’une interface de coloration plus dense, en contact avec du tissu osseux immature (^{fig. 9}). Cette couche, semblable à une ligne d’inversion, n’est pas présente dans les zones qui ne montrent pas une apposition directe de tissu osseux ou qui font l’objet d’un processus de résorption, et elle semble établir une relation étroite avec le tissu osseux néoformé. À proximité des bords du défaut, les trabécules osseuses sont plus développés, plus épais et contiennent une plus grande quantité de tissu osseux lamellaire, par rapport au trabécules centraux. La présence de tissu osseux néoformé semble être plus évidente à proximité de l’endocrâne que près du péricrâne.

Au bout de 4 semaines, on observe une importante densité de trabécules osseuses à un stade avancé d’organisation et de maturation par rapport à la période précédente (^{fig. 10} et ¹¹). Le tissu osseux présente, à ce stade, une unité et une solide cohésion avec les particules, reflétant une bonne ostéo-intégration de ce biomatériau. Le tissu osseux immature et les particules d’hydroxyapatite présentent tous les deux un processus de résorption (^{fig. 12}). Ce phénomène, apparemment dû aux cellules de type ostéoclastique, témoigne du processus de remodelage. On observe également du tissu osseux avec des caractéristiques atypiques, ressemblant au tissu osseux lamellaire, mais avec une densité cellulaire plus forte et sans atteindre son organisation. Le péricrâne et l’endocrâne sont tous les deux parfaitement reconstruits.

Discussion

Le modèle animal que nous avons utilisé est celui d’os crânien à cicatrisation différée chez le lapin. Le modèle crânien d’origine chez le lapin est constitué d’un seul défaut de 15 mm (Frame, ¹⁹⁸⁰). Cependant, ce modèle d’origine présente quelques inconvénients : il interfère avec la suture sagittale (risque chirurgical hémorragique plus élevé et possibilité d’interférence du tissu conjonctif avec la cicatrisation), l’impossibilité de produire 2 défauts par animal et une période d’évaluation minimale de 24 semaines. Afin de contourner ces limitations, un modèle d’os crânien à cicatrisation différée a été initialement mis au point par Kramer (Kramer et al., ¹⁹⁶⁸) puis amélioré par Damien (Damien et al., ¹⁹⁹¹) et Parssons (Parssons et al., ¹⁹⁹⁴). Dans notre Service d’odontologie, le modèle d’os crânien à cicatrisation différée est utilisé depuis 2003. Ce modèle consiste en la formation de 2 défauts de 8 mm par animal, un sur chaque os pariétal, sans interférer avec la suture coronaire. Avant la 16^e semaine, ce modèle fonctionne parfaitement en accord avec ses limites, ce qui nous permet de l’utiliser pour des études à court terme. D’un autre côté, le fait de créer 2 défauts par animal permet de faire une comparaison directe entre les modalités expérimentales en réduisant la variabilité individuelle ainsi que le nombre nécessaire d’animaux.

Les défauts non comblés (témoin négatif) montrent une formation osseuse éparse (rare) tant au bout de 2 semaines que de 4 semaines. De petits « îlots » de tissu osseux immature, ressemblant à des centres de formation osseuse, sont visibles au milieu du défaut. Ces « îlots » ont également été observés par d’autres chercheurs (Polimeni et al., ²⁰⁰⁹). Si l’on tient compte de leur rareté à 4 semaines, leur rôle dans la régénération osseuse est faible.

Au niveau du défaut HAn, nous avons pu observer la présence de particules de forme et de dimensions très hétérogènes. Nous pensons que cette hétérogénéité est essentiellement liée au processus de fabrication de l’HAn. Au bout de 2 semaines, nous avons pu voir des particules d’HAn avec des zones festonnées. Celles-ci correspondent au processus de déminéralisation qui semble être lié aux cellules de type ostéoclastique. Nous avons également pu observer une nette apposition de tissu osseux immature sur la surface de l’HAn. Au bout de 4 semaines, on peut voir des particules d’HAn parfaitement ostéo-intégrées et des trabécules osseuses bien organisés, surtout formés d’un abondant tissu osseux lamellaire. Nous pensons que la présence d’une interface active entre les particules d’HAn et le nouveau tissu osseux peut contribuer à l’intense activité ostéogénique. Cette fine couche, très certainement formée par une apatite carbonée, est directement liée à l’apposition de tissu osseux nouveau. Cette apatite, qui ressemble chimiquement à celle présente dans le tissu osseux, intervient certainement dans l’adsorption des protéines et va moduler et servir de médiateur dans le processus d’adhésion cellulaire (LeGeros, ²⁰⁰⁸), en étant coresponsable grâce à l’efficacité de ce biomatériau.

Nous avons pu observer un processus de résorption intense de l’HAn. Ce processus est caractérisé par la présence de lacunes de résorption sur la surface de l’HAn et de cellules multinucléées semblables aux cellules de type ostéoclastique. Ces lacunes de résorption ont également été mentionnées par certains auteurs qui précisent que ces concavités sont visibles au bout 14 jours (Thorwarth et al., ²⁰⁰⁵). Ces résultats sont en accord avec les nôtres. D’autres auteurs (Chris Arts et al., ²⁰⁰⁶) ont également trouvé des cellules de résorption sur la surface d’une hydroxyapatite nanocristalline. Ces cellules, TRAP positives, étaient des ostéoclastes impliqués dans un processus de résorption osseuse. Ces mêmes auteurs ont également observé des vides entre l’hydroxyapatite et l’os néoformé. Ces observations sont en accord avec les nôtres. Sans exclure une dégradation physico-chimique, nous pensons qu’il est possible de dire que cette population cellulaire est partiellement responsable du processus de dégradation observé. Cette observation a également été rapportée par d’autres auteurs (Oonishi et al., ¹⁹⁹⁹ ; Allegrini et al., ²⁰⁰⁶ ; Manjubala et al., ²⁰⁰²). La présence de nanocristaux de phosphate de calcium, de taille similaire à ceux présents dans le tissu osseux naturel (nanométriquement naturels), pourrait favoriser l’activité ostéoclastique à leur surface. À 4 semaines postopératoires, notre hydroxyapatite expérimentale présente encore des quantités non résorbées considérables, voisinant avec d’autres parties totalement ostéo-intégrées. Un an après implémentation, Spies et al. ont détecté des quantités significatives d’hydroxyapatite nanocristalline (Spies et al., ²⁰⁰⁸). Selon ces auteurs, le processus de dégradation s’arrête au bout de 6 semaines. Dans la même ligne de résultats, des signes limités de dégradation d’une hydroxyapatite nanocristalline ont été observés au bout de 1 mois (Huber et al., ²⁰⁰⁹). Cependant, ces résultats sont en désaccord avec ceux d’autres auteurs (Thorwarth et al., ²⁰⁰⁵). À 1 mois postopératoire, ces derniers trouvent seulement de petites zones d’hydroxyapatite nanocristalline synthétique. Les recherches entreprises dans ce domaine suggèrent que la ressemblance entre les matériaux synthétiques et l’os naturel (composition, taille et morphologie) pourraient améliorer leur ostéoconductivité (Du et al., ¹⁹⁹⁹). Les nanocristaux produisent une surface bioactive, large (10⁶ m²/g), qui est censée promouvoir leur colonisation par les ostéoblastes (Thorwarth et al., ²⁰⁰⁵). Le fait que les nanocristaux de PCa ont une organisation structurelle faible va également faciliter leur dégradation (Muller-Mai et al., ²⁰⁰¹). L’architecture de cette HAn, qui est inspirée de la biologie, pourrait être à la base de son succès biologique. Les résultats cliniques obtenus chez l’homme avec une hydroxyapatite nanocristalline se sont révélés positif pour le traitement de défauts intra-osseux parodontaux (Kasaj et al., ²⁰⁰⁸).

Nous pensons qu’il faudrait entreprendre non seulement de nouvelles études sur ce biomatériau, mais également des recherches cytochimiques sur les populations cellulaires observées.

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