Analyse du biofilm observé au MEB après traitement ultrasonique à l'aide d'une sonde EDS

Introduction

Jusqu'à aujourd'hui, l'objectif des thérapeutiques parodontales a été d'arrêter la progression de la parodontite en contrôlant son premier facteur étiologique, la plaque dentaire (^{Greenstein, 1992} ; ^{Breininger et al., 1987}), qui peut être assimilée de manière générale à ce qu'on appelle un biofilm. Celui-ci se définit comme un ensemble de populations bactériennes solidaires entre elles au sein d'une matrice glycoprotéinique grâce à l'élaboration de phénomènes complexes d'adhérence (^{Costerton et al., 1994}). Cette structure micro-biologique est particulièrement difficile à éliminer par les techniques d'hygiène bucco-dentaire classiques quotidiennes au niveau sous-gingival, qu'elles soient mécaniques ou chimiques (brossage, pâte gingivale ou bain de bouche antiseptique) (^{Darveau et al., 1997}).

En conséquence, la recherche des méthodes cliniques les plus efficaces demeure essentielle pour le praticien. Parmi ces moyens, il dispose du détartrage et du surfaçage radiculaire (^{Garnick et Dent, 1989}), manuel ou ultrasonique. De nombreuses études confirment la nette amélioration de l'état de santé parodontal après ces traitements qui modifient le métabolisme anaérobie de la flore bactérienne pathogène initiale et l'oriente vers un métabolisme aérobie (^{Adams et al., 1996}).

D'autres études ont précisé la supériorité des techniques ultrasoniques sur l'usage des curettes manuelles vis-à-vis du biofilm, du tartre et d'autres débris irritants pour le parodonte (^{Brent Scott et al., 1999} ; ^{Gagnot et al., 1998} ; ^{Himeno, 1994} ; ^{Da Costa Noble et al., 1993} ; ^{Drisko, 1993} ; ^{Dragoo, 1992} ; ^{Thilo et Baëhni, 1987} ; ^{Loos et al., 1987} ; ^{Thornton et Garnick, 1982} ; ^{Stende et Schaffer, 1961}). Pour cette raison, elles ont été adoptées par de nombreux praticiens à toutes les étapes du traitement parodontal : lors de la préparation initiale, de la phase chirurgicale et, enfin, de la phase de maintenance (^{Drisko, 1998}).

Le traitement ultrasonique facilite un débridement de la surface radiculaire par une désorganisation totale de la structure tridimensionnelle du biofilm bactérien. Par ailleurs, on constate clairement qu'il modifie la composition de surface du cément traité (^{Doré, 1999}). Par contre, il n'existe actuellement pas de mesure de la composition du biofilm traité.

De ce fait, l'objectif de cette étude a été de tenter de caractériser chimiquement le biofilm, avant et après traitement ultrasonique, en utilisant l'analyse spectrométrique des rayons X émis après bombardement électronique de la structure bactérienne. Cette analyse est réalisée en mesurant les valeurs du carbone (C), de l'oxygène (O), du calcium (Ca) et du phosphore (P). Ces mesures devraient permettre d'obtenir la composition moyenne organique et minérale du biofilm et, ainsi, autoriser une analyse plus fine de la quantité de biofilm résiduelle sur une surface radiculaire traitée expérimentalement par ultrasons.

Matériel et méthode

Vingt-quatre prélèvements de plaque dentaire ont été effectués sur des patients volontaires, consultant l'unité fonctionnelle de parodontologie (Service de soins dentaires et péri-dentaires, Pr Vulcain). Ils ont été réalisés sans tenir compte des critères habituellement admis (âge, sexe, présence de maladies parodontales et de pathologies générales, suivi d'un traitement local ou général). Cependant, ils ont été effectués sur un parodonte inflammatoire, chez des adultes (de 20 à 60 ans).

Tous les patients présentaient une hygiène bucco-dentaire qualifiée de moyenne à absente, avec une quantité de plaque suffisante pour être prélevée en un seul site (index de plaque > 1, ^{Silness et Loë, 1964}). Le site de prélèvement a été choisi dans les secteurs latéraux maxillaires au niveau des espaces interdentaires. La plaque prélevée était strictement juxtagingivale. Après isolement du site de prélèvement avec un rouleau de coton et une pompe à salive, un excavateur a été utilisé en réalisant une friction douce de la surface dentaire n'occasionnant aucun saignement. L'objectif a été de prélever une plaque sans apport exogène organique ni minéral.

Les prélèvements ont alors été répartis en trois groupes et ont subi les traitements suivants :

- groupe 1 (témoin), les échantillons ont été étalés sur un support de cuivre individuel puis séchés à l'air pendant 48 heures ;

- groupe 2 (traité), la plaque dentaire a été traitée aux ultrasons sans irrigation pendant 1 minute (ultrasons Piezomatic et embout Satelec P10) au sein d'un tube en plastique. Cet échantillon a été recueilli et placé sur une plaque de cuivre puis séché à l'air. Les échantillons des groupes 1 et 2 ont été observés à la sonde EDS (energy dispersive spectrometer) dans une zone plane après leur métallisation par pulvérisation cathodique à l'aide de l'appareil Jeol JFC 1100 ;

- groupe 3 (observation morphologique), les échantillons ont été étalés sur un support en cuivre puis fixés au glutaraldéhyde à 2,5 %, pendant 12 heures, et enfin rincés au tampon cacodylate (3 × 15 min) et conservés au réfrigérateur à + 4 °C. Cet étalement doux permet de respecter les morphotypes bactériens malgré une modification probable des interrelations entre les micro-organismes. Ces échantillons ont été mis en condition pour une observation en microscopie électronique à balayage (MEB) par des déshydratations successives à l'aide de passages dans des bains d'alcool à des degrés croissants (80°, 90°, 100° et acétone, chaque fois pendant 2 × 10 min). Ces mêmes échantillons ont été ensuite traités au point critique en atmosphère de CO₂ pour l'observation et l'analyse morphologique de la plaque bactérienne.

Celle-ci a été réalisée sur les 24 échantillons du groupe 3 aux grossissements × 200, × 2 000 et × 6 000. Elle a servi à une identification globale des morphotypes bactériens majoritaires et de leur densité. Cet examen a pour but de constater une bonne homogénéité et l'absence de noyaux épitactiques de calcification altérant de manière significative les résultats de la sonde EDS. L'analyse de la composition de la plaque en C, O, Ca, P a été pratiquée systématiquement sur les 24 échantillons des groupes 1 et 2 (traités et de contrôle). Le bombardement électronique de l'objet entraîne la formation de rayons X d'énergie caractéristique émis par le point d'impact. L'analyse par la sonde EDS des rayons X permet de mesurer la composition chimique de l'objet au point d'impact, sur un volume de 1 µm³ et sur une surface inférieure à 1 µm². Les valeurs retenues ont été exprimées en pourcentage massique.

Résultats

En microscopie électronique à balayage, l'analyse morphologique des échantillons du groupe 3 révèle un polymorphisme de la flore bactérienne. La plaque jeune montre des colonies de bactéries, en particulier de nombreuses chaînes de cocci, souvent en cours de division (^{fig. 1}). La plaque des échantillons présente généralement des structures en épi de maïs, associées à la notion d'une plaque mature (^{fig. 2}) (^{Mouton, 1974}). Des spirochètes sont également présents, en même temps que des bâtonnets et des filaments (^{fig. 3}). A l'inverse, au sein des échantillons des groupes 1 et 2, l'analyse morphologique est impossible du fait d'un écrasement des structures provoqué par le séchage à l'air (^{fig. 4}).

Les mesures exprimées en pourcentage massique des 4 éléments chimiques sont récapitulées dans le ^{tableau I} et sur la ^{figure 5}. Au sein du groupe témoin, on détermine en moyenne la présence de carbone à 60 ± 3,4 %, d'oxygène à 36,8 ± 3,7 %, de calcium à 0,06 ± 0,3 % et de phosphore à 2,4 ± 3,3 %. Ces valeurs montrent une composition essentiellement organique. Cependant, des sites de calcification ont pu être observés sur certains prélèvements. Dans ce cas, les mesures ont été volontairement écartées pour ne pas biaiser le calcul de la composition moyenne du biofilm.

Les mesures sur les échantillons du groupe traité montrent que la présence de carbone s'élève à 56,5 ± 0,3 %, celle d'oxygène à 37,1 ± 0,8 %, celle de calcium à 2,0 ± 0,1 et celle de phosphore à 3,3 ± 0,4 %. Un test non paramétrique de Wilcoxon a été réalisé pour comparer l'homogénéité des groupes témoins et traités à un seuil de 5 %. Il ne montre pas de différence significative pour l'oxygène et le phosphore alors qu'il en apparaît une pour le carbone et le calcium.

Par ailleurs, au cours de l'étude, des mesures portant sur le pourcentage de cuivre ont été réalisées sur le groupe témoin et le groupe traité (^{tableau II}) sans révéler de différences significatives.

Discussion

Le traitement non chirurgical de la maladie parodontale par une instrumentation ultrasonique a trois objectifs :

- éliminer les dépôts exogènes (plaque dentaire et tartre) ; - obtenir une surface cémentaire lisse ;

- éviter la formation de boue cémentaire.

De nombreuses études ont démontré l'avantage que présente l'utilisation d'instruments ultrasoniques pour la désorganisation du biofilm (^{Walmsley et al., 1988} et ¹⁹⁹⁰) soit par rapport à l'usage des curettes manuelles (^{Drisko et Lewis, 1996} ; ^{Breininger et al., 1987}), soit par l'étude attentive de la boue cémentaire résiduelle sur le cément (^{Blomlof et al., 1997}) ou encore en association avec une irrigation sous-gingivale (^{Higashi et Okamoto, 1995}).

Des études bactériologiques (^{Oosterwaal et al., 1987} ; ^{Leon et Vogel, 1987} ; ^{Loos et al., 1988}) concernant les effets des inserts ultrasoniques sur la microflore de la plaque dentaire ont montré que le débridement sous-gingival avec des inserts ultrasoniques provoquait des changements dans la composition microbienne de la plaque dentaire. Les résultats de l'étude menée par ^{Thilo et Baëhni (1987)} montraient que ce type d'instrumentation affectait la composition de la plaque dentaire in vitro. Les changements bactériens selon l'instrumentation utilisée étaient caractérisés par une réduction des spirochètes et des bâtonnets mobiles avec une augmentation concomitante des cocci. Cependant, la diminution en pourcentage des spirochètes après ultrasonification de la plaque avec des inserts reflète une réelle réduction du nombre de cellules due à leur mort et leur désintégration. De plus, les inserts ultrasoniques opérant à de hautes fréquences génèrent un effet cavitationnel (^{Walmsley et al., 1984}), phénomène connu pour ses effets destructeurs sur la cellule, bien qu'une étude menée par ^{Himeno et al. (1991)} recommande d'utiliser une puissance aussi basse que possible pour éviter d'endommager la surface saine du cément. Les changements qualitatifs de la flore bactérienne de la plaque observés in vitro pourraient probablement être attribués à l'action combinée des vibrations et de l'effet cavitationnel, auxquels s'ajoute le flux d'air du spray (^{Thilo et Baëhni, 1987}). ^{Walmsley et al. (1988} et ¹⁹⁹⁰⁾ suggéraient que les inserts ultrasoniques avaient un effet bactéricide sur la plaque par cavitation. Cependant, une étude récente (^{Schenk et al., 1999}) a prouvé que le premier effet des inserts ultrasoniques est l'ablation mécanique de la plaque et non pas un effet bactéricide sur Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Campylobacter rectus et Peptostreptococcus micros in vitro.

Des études réalisées par ^{Checci et Pelliccioni (1988)} ont montré que les instruments ultrasoniques étaient également efficaces dans l'élimination des endotoxines adhérentes aux surfaces radiculaires. Cette découverte est consécutive aux déductions affirmant que des endotoxines sont liées à la surface radiculaire et facilement éliminées par les phénomènes dominants cavitationnels associés aux ultrasons dont on peut penser qu'ils ont un effet accessoire sur la plaque et sur l'élimination des endotoxines (^{Moore et al., 1986} ; ^{Walmsley et al., 1990}).

Une étude récente (^{Doré, 1999}) a montré des modifications significatives dans la composition en masse de la surface du cément après utilisation des inserts ultrasoniques Twiny (de Satelec) sur 21 dents monoradiculées extraites durant le traitement initial à la suite d'une perte osseuse sévère ou terminale. Cependant, les résultats ne peuvent pas spécifier si les modifications observées proviennent du traitement de la surface du cément ou de la désorganisation du biofilm. Une autre étude (^{Michel et al., 2000}) a étudié in vivo les effets dus au traitement ultrasonique utilisant les inserts ultrasoniques H2 et H4 de Satelec sur les surfaces radiculaires de 10 dents pluriradiculées dans la région de la furcation. L'analyse de ces surfaces était effectuée par une sonde EDS et révélait qu'une modification dans la composition organique de la surface du cément était évidente après le passage des inserts mentionnés. De plus, les résultats de l'étude présente montrent que l'instrumentation ultrasonique ne modifie pas significativement les paramètres de la composition massique du biofilm pour l'oxygène et le phosphore. Par contre, les valeurs pour le carbone et le calcium sont modifiées. Les raisons de ces variations sont difficiles à déterminer et restent peu évidentes. Il est possible de penser qu'elles sont dues à la désorganisation des noyaux de calcification en cours de formation à l'intérieur du biofilm ou à la libération du calcium intracellulaire lors de la destruction de la cellule bactérienne sur les échantillons traités.

Quand on compare ces résultats à ceux des études réalisées par ^{Doré (1999)} et ^{Michel et al. (2000)}, les modifications observées dans les études précédentes ont des résultats positifs sur la modification des conditions de surface du cément par l'action d'un traitement ultrasonique. Ceci suggère que, en se fondant sur les résultats de cette étude, la composition du biofilm n'est pas altérée mais que les objectifs du traitement non chirurgical par une instrumentation ultrasonique peuvent être atteints avec succès.

Les données recueillies offrent une base pour une compréhension plus approfondie qu'auparavant des effets de l'instrumentation ultrasonique sur la composition en masse du biofilm. Nous suggérons que cette méthode soit utilisée comme modèle dans l'approche de l'observation du biofilm.

Remerciements

Les auteurs remercient M. Lelannic (Laboratoire de microscopie électronique à balayage, Université de Rennes-I, Beaulieu), pour son aide précieuse lors des séances d'observation au microscope électronique à balayage.

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